Di impianto basilicale, a tre navate divise da colonne  con capitelli ionici di tarda età imperiale, ha nella navata centrale grandi tele raffiguranti episodi del Vecchio e del Nuovo Testamento opera dell'Aliense (1592-94), inquadrate in una decorazione ad affresco che investe lo spazio tra le tele, gli archi, i sottarchi sviluppandosi anche nelle navate laterali. L'altar maggiore è composto da colonne, pilastri, nicchie e cupola di rari marmi policromi.

Nella navata destra sono raffigurati personaggi legati alla chiesa come San Pietro Vincioli, San Benedetto, Santa Scolastica, San Mauro e San Gregorio Magno.
Lungo la parete sono anche la cappella di San Giuseppe decorata nel 1855 da Domenico Bruschi e la cappella delle Reliquie con cancellata in ferro battuto e stucchi del Cinquecento e affreschi di Benedetto Bandiera. Ai lati dell'ingresso al presbiterio sono due dipinti di Gian Domenico Cerrini (Vergine che allatta il Bambino e San Giovanni Battista). All'interno del presbiterio è il coro ligneo intarsiato (1525-1535), tra i più belli d'Italia.

La sagrestia, edificata nel 1451, conserva affreschi nella volta con Storie dell'Antico Testamento forse di un maestro fiammingo mentre alle pareti Storie di San Pietro e Paolo di Vincenzo Danti, artista di stile michelangiolesco e cinque quadretti di Perugino con immagini di santi per la tavola dell'Ascensione requisita dai francesi ed oggi a Lione.

La navata sinistra presenta lungo le pareti opere notevoli come una Pietà, parte dello smembrato polittico di San Agostino proveniente dalla chiesa di Sant'Agostino di Pietro Perugino. Nella cappella Vibi notevoli il dossale marmoreo con  Gesù fanciullo, il Battista e San Girolamo (1453) attribuito a Mino da Fiesole, un'Annunciazione di Giovan Battista Caporali e una Visitazione di Stefano Ciburri (1530). Segue la cappella Ranieri con volta decorata da pitture di Annibale Brugnoli (XIX) sopra un precedente decorazione del Caporali.

La cappella del Sacramento ha invece volta decorata da Francesco Appiani e Pietro Carattoli. Sull'altare  è collocata un immagine della Madonna del giglio del XIV secolo posta al centro di un dipinto che raffigura San Pietro e San Paolo di Jean Baptiste Wicar (XIX secolo).
In controfacciata è una grande tela  della fine del XVI secolo con il Trionfo dell'ordine benedettino.
Usciti dalla chiesa, attraversato il primo chiostro, di cui si è già detto si prenda il corridoio che porta al secondo chiostro impostato su tre piani con pozzo al centro. Ancora più avanti è l'antico refettorio con lavabo in terracotta invetriata raffigurante  la Samaritana al pozzo opera del XV secolo, attribuita a Benedetto Buglione. Un terzo chiostro anche detto "chiostro delle stelle" è opera di Galeazzo Alessi.

Curiosità
Nell'antica peschiera dei monaci è l'orto medievale che presenta una interessante lettura in chiave simbolica del giardino di un tempo. 
Poco distante si trova l'orto botanico, che contiene anche un giardino alpino, un giardino zen, un laghetto con piante ombrofile. 
Oggi l'orto botanico svolge una importante funzione didattico-educativa anche per le varie interazioni naturalistico-ambientali.

Informazioni e consigli utili
La chiesa si trova nella parte meridionale della città ed è facilmente raggiungibile a piedi  lasciando i propri mezzi di trasporto nei parcheggi circostanti il centro storico.