L’iconografia del dipinto è nota: la leggenda del martirio è riferita da una Passio Sancti Sebastiani, tradizionalmente assegnata a sant’Ambrogio ma verosimilmente composta da un monaco romano sullo scorcio del V secolo e poi presente nella Legenda Aurea di Iacopo da Varazze. Vi si narra che Sebastiano era nato nel 256 d.C. da una famiglia originaria della cittadina di Narbona in Provenza, che militò come soldato tra i pretoriani, per poi entrare a far parte della guardia imperiale. Convertitosi al cristianesimo, fu scoperto da Diocleziano, il quale, adirato, ordinò che fosse condotto in mezzo a un campo, legato a un bersaglio e colpito dagli arcieri.

Il luogo del supplizio fu visitato da una vedova di nome Irene che, sorpresa dal fatto che Sebastiano fosse ancora vivo, lo portò nel suo palazzo e curò le sue ferite. Diocleziano, alla notizia che il suo soldato era riuscito a salvarsi, diede subito ordine che fosse catturato di nuovo e flagellato a morte. Il supplizio delle frecce, al quale san Sebastiano riuscì a scampare, contribuì fortemente a diffonderne la fama di depulsor pestilentiae.

La scena del Martirio è rappresentata in una sala che presenta sontuose decorazioni architettoniche, a mostrare le conoscenze prospettiche acquistate dal più grande maestro di quest’arte in quel tempo, Piero della Francesca. Il colore è ancora brillante e trasparente, come quando fu applicato sull’intonaco umido, e conserva lo splendore che contraddistingue la vera pittura a fresco. Il Martire occupa il centro della composizione e ne costituisce il soggetto principale; è legato a una colonna di porfido posta sopra un piedistallo. Le proporzioni esatte della figura, l’ammirevole descrizione di tutte le sue parti, mostrano lo studio dedicato da Pietro alle forme umane.

Lo spettatore può ammirare la divina rassegnazione del santo; gli strumenti di tortura sono tenuti quanto più possibile fuori dalla vista. Anche i carnefici sembrano avere assorbito lo spirito dell’eroe cristiano e compiono il loro dovere con malinconica tenerezza. Le teste degli arcieri sono di singolare bellezza e grazia e rammentano Raffaello. Due gruppi di spettatori occupano il piano di fondo e servono a completare la composizione. Il portico è aperto ed elegante, tra gli archi si vedono le colline che circondano Panicale e l’azzurro del lago Trasimeno. Sul piedistallo che sostiene il Martire è scritto il nome del pittore, e sui pilastri del portico la data 1505. Pietro aveva allora 59 anni.

Circa dieci anni prima si era stabilito a Perugia, dopo aver ottenuto la fama con l’esecuzione di grandi lavori a Firenze e a Roma. Quando dipinse a Panicale, la sua fama era al culmine. Pietro ripeté più di una volta il soggetto del Martirio di san Sebastiano: si può ricordare un dipinto su tavola esistente a Perugia nella chiesa di San Francesco dei Conventuali, che fu eseguito tredici anni più tardi, quando l’età ne aveva indebolito le capacità.