Die Ikonographie des Gemäldes ist bekannt: Die Legende des Martyriums wird in einer Passio Sancti Sebastiani erzählt, die traditionell dem heiligen Ambrosius zugeschrieben, aber wahrscheinlich von einem römischen Mönch gegen Ende des 5. Jahrhunderts verfasst und später in der Legenda Aurea von Jacobus de Voragine aufgenommen wurde. Darin wird erzählt, dass Sebastian im Jahr 256 n. Chr. in eine Familie aus der Stadt Narbonne in der Provence hineingeboren wurde, als Soldat in der Prätorianergarde diente und später der kaiserlichen Garde angehörte. Nachdem er zum Christentum konvertiert war, wurde er von Diokletian entdeckt, der wütend befahl, ihn auf einem Feld an eine Zielscheibe zu binden und von Bogenschützen beschießen zu lassen.

Der Ort des Martyriums wurde von einer Witwe namens Irene besucht, die, überrascht, dass Sebastian noch am Leben war, ihn in ihren Palast brachte und seine Wunden pflegte. Als Diokletian erfuhr, dass sein Soldat überlebt hatte, ordnete er sofort an, ihn erneut gefangen zu nehmen und zu Tode zu geißeln. Die Tortur der Pfeile, der Sebastian entkommen konnte, trug maßgeblich dazu bei, seinen Ruf als depulsor pestilentiae (Vertreiber der Pest) zu festigen.

Die Szene des Martyriums wird in einem Saal dargestellt, der prächtige architektonische Dekorationen aufweist, welche die perspektivischen Kenntnisse des größten Meisters dieser Kunst, Piero della Francesca, widerspiegeln. Die Farben sind noch immer leuchtend und transparent, wie sie auf den frischen Putz aufgetragen wurden, und bewahren den Glanz, der die wahre Freskenmalerei auszeichnet. Der Märtyrer nimmt die Mitte der Komposition ein und bildet ihr Hauptmotiv; er ist an eine Porphyrsäule gebunden, die auf einem Sockel steht. Die genauen Proportionen der Figur und die bewundernswerte Darstellung all ihrer Teile zeigen das Studium, das Pietro der menschlichen Form gewidmet hat.

Der Betrachter kann die göttliche Gelassenheit des Heiligen bewundern; die Folterinstrumente werden so weit wie möglich außer Sicht gehalten. Auch die Henker scheinen den Geist des christlichen Helden aufgenommen zu haben und verrichten ihre Pflicht mit melancholischer Zärtlichkeit. Die Köpfe der Bogenschützen sind von besonderer Schönheit und Anmut und erinnern an Raffael. Zwei Gruppen von Zuschauern befinden sich im Hintergrund und vervollständigen die Komposition. Der Portikus ist offen und elegant, zwischen den Bögen sind die Hügel zu sehen, die Panicale umgeben, sowie das Blau des Trasimenischen Sees. Auf dem Sockel, der den Märtyrer trägt, ist der Name des Malers eingraviert, und auf den Säulen des Portikus die Jahreszahl 1505. Pietro war damals 59 Jahre alt.

Etwa zehn Jahre zuvor hatte er sich in Perugia niedergelassen, nachdem er sich mit bedeutenden Arbeiten in Florenz und Rom einen Namen gemacht hatte. Als er in Panicale malte, befand sich sein Ruhm auf dem Höhepunkt. Pietro wiederholte das Thema des Martyriums des heiligen Sebastian mehr als einmal: Ein Gemälde auf Holz, das sich in der Kirche San Francesco dei Conventuali in Perugia befindet, wurde dreizehn Jahre später ausgeführt, als das Alter seine Fähigkeiten bereits geschwächt hatte.